Production industrielle et profilage fonctionnel du probiotique Pediococcus acidilactici 72 N pour une utilisation potentielle comme additif alimentaire pour porcs | Rapports scientifiques

Scientific Reports volume 15, Numéro d'article : 14940 (2025) Citer cet article

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Cette étude visait à produire à l'échelle industrielle la souche probiotique Pediococcus acidilactici 72 N (P72N), issue de porcs natifs thaïlandais, à l'aide d'un milieu modifié de qualité alimentaire, économique, et à évaluer l'efficacité de ce milieu en évaluant les caractéristiques fonctionnelles et le profil métabolomique du probiotique. Des techniques d'optimisation conventionnelles et statistiques ont été utilisées pour sélectionner des sources de carbone (glucose, dextrose, saccharose) et d'azote (extrait de bœuf, extrait de levure, lactosérum doux) de qualité alimentaire afin de développer la formulation optimale. Le milieu final contenait 10 g/L de dextrose, 45 g/L d'extrait de levure, 5 g/L d'acétate de sodium, 2 g/L de citrate d'ammonium, 2 g/L d'hydrogénophosphate dipotassique, 1 g/L de Tween 80, 0,1 g/L de sulfate de magnésium et 0,05 g/L de sulfate de manganèse. Cette formulation a permis d'obtenir un nombre de cellules viables significativement plus élevé que le milieu MRS commercial. Français La fermentation à grande échelle dans des fermenteurs de 5 L et 50 L dans des conditions contrôlées (37 °C, pH 6,5, 120 tr/min) a produit des numérations de cellules viables supérieures à 9,60 log UFC/mL en 12 h, réduisant les coûts de production de 67 à 86 %. Le P72N dans le milieu modifié a démontré une tolérance améliorée aux stress environnementaux. L'analyse métabolomique a révélé que le P72N produisait une variété de métabolites bioactifs, en particulier l'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque (1,4-DHNA) et l'acide indolelactique (ILA) qui ont été détectés à des niveaux plus élevés dans le milieu modifié, démontrant son adéquation à la production industrielle de P72N comme additif alimentaire potentiel pour l'élevage porcin.

Les probiotiques sont reconnus pour améliorer les performances de croissance et la santé globale des porcs, contribuant ainsi à une production alimentaire plus sûre et plus durable. En modulant le microbiome intestinal, les probiotiques améliorent l'absorption des nutriments et la fonction immunitaire, favorisant ainsi une meilleure efficacité alimentaire, des taux de croissance et une meilleure santé globale du bétail1. Cela réduit ainsi le besoin d'antibiotiques, s'inscrivant dans la tendance vers un élevage sans antibiotiques et réduisant la prévalence des bactéries pathogènes. Par conséquent, la demande de probiotiques dans l'alimentation porcine est en hausse, ce qui nécessite une production industrielle efficace et économique pour répondre aux exigences de l'élevage moderne. Cette production de probiotiques implique plusieurs étapes de développement clés, notamment la sélection des souches, l'identification d'un milieu de fermentation optimal et la transformation en aval. Lors de la sélection des souches probiotiques pour la production industrielle, il est essentiel de choisir celles qui présentent un potentiel de rendement élevé, une robustesse, une stabilité génétique, une évolutivité, une viabilité, une sécurité, des avantages fonctionnels et une rentabilité élevée afin de garantir une production à grande échelle efficace tout en maintenant la qualité et la conformité2. Français La souche probiotique utilisée dans cette étude était la souche 72 N de Pediococcus acidilactici (P72N), une bactérie lactique (LAB) qui a été isolée à partir de matières fécales de porcs indigènes thaïlandais, et qui est connue pour son potentiel probiotique et sa sécurité, y compris l'absence de gènes de résistance aux antimicrobiens, conformément aux normes de l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA)3. P72N a démontré des activités antibactériennes, antivirales, anti-conjugaison et anti-biofilm in vitro4,5,6. Un protocole de microencapsulation à double revêtement pour P72N a également été développé, et son utilisation a montré des avantages pour la santé intestinale et la croissance des porcs7,8,9.

Un autre facteur critique de l'efficacité de la production est le milieu de fermentation, qui peut représenter 30 à 40 % des coûts de production10. Les milieux standards comme MRS et M17 sont coûteux et peuvent ne pas offrir des conditions optimales pour toutes les souches LAB11. Par conséquent, les formulations de milieux modifiées et l'optimisation adaptées aux besoins nutritionnels de souches spécifiques sont devenues un domaine de recherche croissant. Des techniques d'optimisation comme la méthode OVAT (One-Variable-at-A-Time), le plan de Plackett-Burman (PBD), la méthodologie de surface de réponse (RSM) et le plan factoriel aident à optimiser la composition des milieux pour une production rentable12. Dans les procédés de fermentation industrielle, les sources de carbone et d'azote sont essentielles à la fermentation LAB. L'ajustement des ratios de sources de carbone en fonction des besoins spécifiques des souches microbiennes utilisées est essentiel pour éviter la présence de sucres résiduels dans le milieu de fermentation. Les sources d'azote provenant des industries agroalimentaires, telles que les protéines de lactosérum, les extraits de levure et les extraits de viande, sont apparues comme des alternatives prometteuses pour la formulation des milieux de culture10,11,13,14. L’optimisation des conditions de fermentation telles que la température, les valeurs de pH et la vitesse d’agitation est également cruciale pour maximiser le rendement et maintenir la qualité du produit dans les processus de fermentation industrielle12.

Des études ont montré que la composition des milieux de croissance peut avoir un impact significatif sur l'expression de caractéristiques probiotiques clés, notamment la résistance aux sels biliaires, la tolérance aux faibles pH et la production de composés bioactifs15,16,17,18. Il est donc essentiel d'évaluer la qualité et l'efficacité des probiotiques dans les milieux nouvellement modifiés afin de garantir le maintien de ces caractéristiques fonctionnelles essentielles. L'analyse métabolomique par LC-MS est un outil important pour détecter et caractériser les altérations métaboliques en réponse aux changements de milieux de croissance, permettant une compréhension globale des adaptations cellulaires et des changements métaboliques.

À ce jour, la plupart des études d'optimisation des milieux de culture ont privilégié la rentabilité et le rendement en biomasse, négligeant souvent la préservation des caractéristiques probiotiques spécifiques à la souche. En revanche, cette étude présente une approche novatrice en développant un milieu de culture de qualité alimentaire et économique, spécialement conçu pour la production industrielle de la souche probiotique thaïlandaise native de porcs Pediococcus acidilactici 72 N (P72N), tout en évaluant simultanément son intégrité fonctionnelle. En intégrant l'analyse des performances de croissance à une évaluation détaillée des caractéristiques probiotiques et au profilage métabolomique par LC-MS, ces travaux fournissent un cadre complet pour l'optimisation des milieux de culture, garantissant à la fois la faisabilité économique et le maintien de l'efficacité probiotique, un domaine largement sous-exploré dans la littérature actuelle.

Français Le criblage préliminaire utilisant la méthode OVAT visait à sélectionner la source de carbone ayant un impact significatif sur la production de cellules P72N. Les effets des sources de carbone sur la production de cellules viables de P72N à 24 h d'incubation sont présentés dans la Fig. 1. Le nombre de cellules viables P27N dans des concentrations de 10 g/L, 20/L et 30 g/L de glucose était de 7,92 ± 0,02, 8,02 ± 0,02 et 8,05 ± 0,02 log UFC/ml ; pour le saccharose, ils étaient de 7,89 ± 0,08, 7,66 ± 0,04 et 7,77 ± 0,07 log UFC/ml ; et pour le dextrose, ils étaient de 8,00 ± 0,03, 8,19 ± 0,06 et 7,86 ± 0,06 log UFC/ml (tableau supplémentaire S1). Étant donné que la production cellulaire la plus élevée s'est produite dans 20 g/L de dextrose (p < 0,05), il a été sélectionné comme source de carbone optimale pour d'autres expériences (Fig. 1).

L'effet des sources de carbone sur la production de cellules viables de P72N à 24 h d'incubation.

Français La matrice expérimentale du plan Plackett-Burman et la réponse (numération cellulaire) pour P72N après 24 h d'incubation sont présentées dans le tableau 1, où la production de cellules viables variait de 8,70 ± 0,10 à 8,99 ± 0,12 log UFC/ml. Les effets standardisés des variables pour P72N sont illustrés par des colonnes individuelles dans les diagrammes de Pareto présentés dans la figure 2A. La colonne passant par la ligne verticale (pointillée) indique une signification statistique, ce qui signifie que la variable a eu un impact significatif sur la numération cellulaire. L'extrait de levure était la seule source d'azote à avoir un effet important sur la production de cellules viables, et était la seule source d'azote ayant un effet significatif (p < 0,0001) (figure 2A et tableau supplémentaire S2). Français L'adéquation du modèle expérimental peut être expliquée par la valeur du coefficient de détermination (R2. Le coefficient de détermination était élevé (R2 = 0,9459), et les valeurs du coefficient de détermination ajusté (adj-R2 = 0,9256) et du coefficient de détermination prédit (pred-R2 = 0,8783) étaient en accord raisonnable. La précision du modèle a également été démontrée par un manque d'ajustement statistiquement non significatif (p > 0,05). Le manque d'ajustement non significatif de la valeur dans cette expérience (p = 0,066) a confirmé l'adéquation du modèle pour décrire les données (tableau S2). Par conséquent, l'extrait de levure a été sélectionné comme seule source d'azote pour la croissance de P. acidilactici 72 N dans les expériences RSM ultérieures.

Diagramme de Pareto montrant les effets standardisés de trois sources d'azote sur la production de cellules viables de P72N. Les colonnes grises et noires représentent les effets positifs et négatifs sur la production de cellules viables (A). Graphique de contour pour la production de cellules viables de P72N montrant l'interaction entre le dextrose et l'extrait de levure (B).

Le tableau 2 présente le modèle RSM avec dispositif composite central (CCD) composé de 13 cycles, chacun avec trois réplicats, ainsi que le nombre de cellules obtenues après 24 h d'incubation. La production de cellules viables variait de 8,88 ± 0,16 à 9,20 ± 0,06 log UFC/ml. Bien que le nombre de cellules viables le plus élevé (9,20 ± 0,06 log UFC/ml) ait été observé lors du cycle 6, il n'était pas significativement différent de celui des cycles expérimentaux 1, 4, 5, 7, 10, 11, 12 et 13. Le nombre de cellules de réponse a été analysé par régression multiple. L'équation polynomiale du second ordre, qui exprimait la relation entre la réponse prédite et les variables, était la suivante :

où X1 et X2 sont respectivement du dextrose et de l'extrait de levure.

La signification du modèle de régression quadratique avec des termes linéaires, carrés et d'interaction est présentée dans un tableau ANOVA (tableau supplémentaire S3). Français Le coefficient de détermination (R2 était de 0,9899, ce qui implique que 98,99 % de la variation de la réponse était expliquée par le modèle. Les valeurs de adj-R2 (0,9827) et pred-R2 (0,9484) étaient en accord acceptable. De plus, le test d'absence d'ajustement (p = 0,212) a vérifié que le modèle était adapté à l'explication des données. Les effets linéaires et quadratiques du dextrose (X1) et de l'extrait de levure (X2) ont affecté de manière significative le nombre de cellules (p < 0,0001). Le dextrose et l'extrait de levure pourraient agir comme des nutriments limitants car les effets au carré des deux variables étaient hautement significatifs (p < 0,0001). Le graphique de contour est présenté à la Fig. 3, illustrant les interactions entre les deux variables et déduisant la concentration optimale pour une production cellulaire maximale. Le nombre de cellules viables a augmenté à une concentration de dextrose comprise entre 18 g/L et 28 g/L et à une concentration d'extrait de levure comprise entre 55 g/L à 65 g/L, et a diminué aux concentrations au-delà de cette plage. Il n'y avait aucune interaction entre les variables (X1 × 2) car le tracé de contour était rond et la valeur de probabilité était faible (p > 0,05) (Fig. 2B et Tableau S3).

Fermentation de P72N dans un flacon de 250 ml en utilisant le milieu modifié MM2 (A) et dans un flacon de 500 ml en utilisant le milieu MM2 comparé au milieu MRS (B) à 37 °C pendant 24 h avec une vitesse d'agitation de 120 tr/min, montrant le nombre de cellules, les valeurs de pH et les sucres résiduels.

Français Le modèle de régression a prédit que la formulation optimale contenait 23 g/L de dextrose et 61,5 g/L d'extrait de levure, avec une concentration maximale de biomasse de 9,21 log UFC/ml, avec un intervalle de confiance à 95 % compris entre 9,19 et 9,23 log UFC/ml. La formulation prédite a été confirmée dans les conditions optimisées en réalisant des expériences indépendantes en triple, et la biomasse s'est avérée être de 9,24 ± 0,03 log UFC/ml. Le modèle a montré une bonne concordance avec la valeur prédite, et la valeur expérimentale se situait dans la plage de l'intervalle de confiance à 95 %. Cependant, comparée à la formulation prédite, la formulation expérimentale avec une concentration de 20 g/L de dextrose et 45 g/L d'extrait de levure (coûtant 2,42 USD/L) a été considérée comme financièrement acceptable, tout en produisant un nombre de cellules viables de 9,13 ± 0,02–9,16 ± 0,01 log UFC/ml. Ainsi, la formulation avec une concentration de 20 g/L de dextrose, 45 g/L d'extrait de levure, 1 g/L de Tween 80, 2 g/L de C6H14N2O7, 2 g/L de K2HPO4, 5 g/L de CH3COONa, 0,1 g/L de MgSO4.7H2O et 0,05 g/L de MnSO4.H2O a été initialement choisie comme milieu modifié (MM1) pour la croissance de P72N.

Avant de procéder à la fermentation à grande échelle, la teneur en sucres résiduels du MM1 a été évaluée en fermentant le P72N dans un flacon de 250 ml pendant 24 h à 37 °C. Une quantité considérable de sucres résiduels a été retrouvée dans le milieu à la fin de la fermentation. Par conséquent, la concentration en dextrose du MM1 a été réduite de 20 g à 10 g. Cette modification n'a pas eu d'impact négatif sur la production de cellules viables (figure supplémentaire S1). Par conséquent, une formulation finale contenant 10 g/L de dextrose, 45 g/L d'extrait de levure, 1 g/L de Tween 80, 2 g/L de C6H14N2O7, 2 g/L de K2HPO4, 5 g/L de CH3COONa, 0,1 g/L de MgSO4.7H2O et 0,05 g/L de MnSO4.H2O a été utilisée comme milieu modifié alternatif (MM2) pour P72N dans les processus de fermentation ultérieurs.

Français Le nombre de cellules, les valeurs de pH et les sucres résiduels après fermentation de P72N dans un flacon de 250 ml en utilisant MM2 à 37 °C pendant 24 h avec différentes vitesses d'agitation sont présentés dans le tableau supplémentaire 4. Un nombre de cellules de 9,21 ± 0,07 log UFC/ml avec une valeur de pH de 4,13 ± 0,01 et des sucres résiduels de 5,24 ± 0,07 ont été obtenus après une période de fermentation plus courte de 12 h à une vitesse d'agitation de 120 tr/min (Fig. 3A et tableau supplémentaire S4). Par conséquent, dans toutes les expériences ultérieures de mise à l'échelle, une vitesse d'agitation de 120 tr/min a été sélectionnée.

Français Lorsque P72N a été cultivé dans un flacon de 500 mL, des nombres de cellules de 9,70 ± 0,02 log UFC/ml ont été observés à un temps de fermentation de 12 h dans MM2, tandis que des nombres de cellules de 9,71 ± 0,07 log UFC/ml ont été observés dans MRS à 15 h de fermentation. Les valeurs de pH et la teneur en sucre résiduel dans MM2 étaient respectivement de 4,35 ± 0,05 et 4,61 ± 0,81 g/L à 12 h de fermentation, tandis que pour MRS, elles étaient respectivement de 4,35 ± 0,09 et 11,00 ± 1,00 g/L à 15 h de fermentation (Fig. 3B et Tableau supplémentaire S5). Sur la base de ces résultats, le MM2 et ses conditions de fermentation optimales (température 37 °C, pH 6,5 ± 0,05 et vitesse d'agitation 120 tr/min) ont donné un rendement cellulaire plus élevé que le MRS et ont donc été sélectionnés comme la combinaison la plus appropriée pour les fermentations à grande échelle dans un bioréacteur de 5 L et un fermenteur de 50 L.

Français La fermentation par lots de P72N a été réalisée en utilisant MM2 dans un bioréacteur de 5 L avec un volume utile de 3,5 L. Comme le montre la Fig. 4A, il y a eu une augmentation rapide des cellules viables détectées de 0 à 6 h d'incubation. Les cellules viables ont persisté en phase stationnaire de 9 h à 18 h, puis ont diminué régulièrement après 18 h. Le nombre de cellules le plus élevé a été observé à 12 h d'incubation (9,66 ± 0,09 log UFC/ml). La valeur du pH du milieu a nettement diminué pour atteindre 4,13 ± 0,02 à 12 h de fermentation, après quoi les valeurs n'étaient pas significativement différentes jusqu'à la fin de la fermentation (24 h). La concentration en sucre dans le milieu a chuté nettement à 1,51 ± 0,06 g/L à 12 h de fermentation. Après 12 h, les valeurs n'étaient pas significativement différentes jusqu'à la fin de la fermentation (24 h) (Tableau supplémentaire S6).

Fermentation de P72N dans un bioréacteur de 5 L (A) et dans un fermenteur de 50 L (B) en utilisant le milieu modifié MM2 à 37 °C pendant 24 h avec une vitesse d'agitation de 120 tr/min, montrant le nombre de cellules, les sucres résiduels et les valeurs de pH.

Français En utilisant MM2, la fermentation par lots de P72N a été réalisée dans un fermenteur de 50 L avec un volume utile de 35 L. Comme le montre la Fig. 4B, une augmentation rapide des cellules viables a été détectée de 0 à 6 h d'incubation. Le nombre de cellules viables est resté en phase stationnaire de 9 h à 18 h, puis a diminué régulièrement. Le nombre de cellules le plus élevé (9,79 ± 0,01 log UFC/ml) a été observé à 12 h d'incubation. La valeur du pH du milieu a été réduite pour atteindre 4,14 ± 0,00 à 12 h de fermentation, après quoi les valeurs n'étaient pas significativement différentes jusqu'à la fin de l'expérience. Les niveaux de sucre dans le milieu ont progressivement diminué pour atteindre 3,34 ± 0,24 g/L à 12 h de fermentation. Après 12 h, aucune des valeurs n'était significativement différente jusqu'à la fin de la fermentation (Tableau S6).

Dans l’ensemble, l’utilisation de MM2 pour P72N a fourni presque les mêmes rendements lors de la mise à l’échelle jusqu’à 5 L et 50 L. Un temps de fermentation plus court de 12 h était le temps de récolte le plus approprié, le nombre maximal de cellules étant supérieur à 9,60 log UFC/ml (tableau 3).

Les coûts par litre de MM2 et des milieux MRS commerciaux sont comparés dans le tableau 4, le coût des ingrédients disponibles en Thaïlande étant calculé en dollars américains en avril 2024. Le coût d'un litre de milieu MRS commercial variait entre 5,94 et 14,34 dollars par litre (selon le fabricant), tandis que celui du MM2 était de 1,95 dollar par litre. Ainsi, le coût du milieu de production pourrait être réduit d'environ 67 à 86 % par rapport au milieu MRS commercial.

Les cellules P72N cultivées en MM étaient significativement plus tolérantes aux sollicitations thermiques et biliaires que celles cultivées en MRS, mais la tolérance à l'oxydation ne différait pas entre les cellules cultivées en MM et en MRS. Les cellules cultivées en MM étaient significativement plus sensibles au stress acide que celles cultivées en MRS, mais les cellules cultivées en MM2 étaient significativement plus tolérantes au stress acide que celles cultivées en MM1, tandis que la tolérance à la chaleur, à l'oxydation et à la bile ne différait pas (Fig. 5).

Différences de tolérance au stress chez P72N cultivé dans un milieu MRS commercial et dans les milieux modifiés MM1 et MM2. Les barres d'erreur représentent les écarts types pour les expériences en triple. a−cLes valeurs avec des exposants différents pour chaque facteur de stress sont significativement différentes (p < 0,05).

Français L'ensemble des profils métaboliques détectés par UHPLC-ESI-Q-TOF-MS a été analysé par analyse statistique multivariée, incluant une analyse en composantes principales (ACP) et une analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA), afin de visualiser les changements métabolomiques avant et après la culture de P72N dans le milieu modifié (MM2) et le milieu MRS. Sur la figure 6A, les tracés des scores ACP montrent des séparations nettes entre le milieu modifié avant (MM2_B) et après (MM2_P) la culture de P72N, tandis que la figure 6B montre un regroupement distinct pour le milieu MRS avant (MRS_B) et après (MRS_P) la culture de P72N, indiquant des altérations métabolomiques significatives induites par P72N. Une analyse plus poussée utilisant des modèles PLS-DA supervisés (Fig. 6C et D) a mis en évidence des différences spécifiques entre les milieux de croissance avant et après la culture. Les valeurs R², Q² et de précision dépassaient 0,9, confirmant la fiabilité du modèle et ses excellentes performances prédictives. Ces résultats ont démontré la validité des modèles PLS-DA, permettant l’extraction de valeurs fiables d’importance variable dans la projection (VIP) à partir de ces modèles.

Graphiques des scores d'analyse en composantes principales (ACP) des milieux modifiés (A) avant la culture P72N (MM2_B) par rapport aux milieux modifiés après la culture P72N (MM2_P) ; (B) Milieux MRS avant la culture P72N (MRS_B) par rapport aux milieux MRS après la culture P72N (MRS_P) ; (C) Graphiques des scores d'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) de MM2_B par rapport à MM2_P ; (D), MRS_B par rapport à MRS_P.

Français Les métabolites différentiellement exprimés ont été identifiés sur la base des résultats d'un test t de Student (p < 0,05) et d'un seuil de changement de log2 de < -2 ou > 2, les résultats étant visualisés dans des graphiques en volcan (Figure supplémentaire S2). Entre MM2_B et MM2_P, 331 métabolites ont été significativement modifiés, avec 154 régulés à la hausse et 177 régulés à la baisse (Figure S2A). Pour MRS_B vs. MRS_P, 763 métabolites étaient significativement différents, dont 377 métabolites régulés à la hausse et 386 métabolites régulés à la baisse (Figure S2B). Français Les métabolites les plus significativement altérés ont été identifiés à l'aide des valeurs d'importance variable dans la projection (VIP) du modèle PLS-DA, avec un seuil de VIP > 2. De MM2_B vs. MM2_P, 136 métabolites avec VIP > 2 ont été identifiés, dont 83 de MM2_B et 53 de MM2_P, tandis que pour MRS_B vs. MRS_P, 100 métabolites avec VIP > 2 ont été identifiés, dont 64 de MRS_B et 39 de MRS_P. La liste de ces métabolites significativement altérés est présentée dans le tableau supplémentaire S7. Le milieu modifié (MM2_B) contenait principalement des peptides, suivis d'acides nucléiques, de vitamines, de lipides et d'autres composés. Il s'agit notamment du valyltryptophane, de l'adénine, de la déthiobiotine, etc. Après 12 h de culture de P72N, des métabolites bioactifs, tels que l'acide indolélactique, l'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque et le 2',4'-dihydroxy-7-méthoxy-8-prénylflavane, etc. ont été trouvés dans le milieu (MM2_P), comme indiqué dans le tableau S7. Français De même, le milieu MRS (MRS_B) comprenait principalement des peptides, des lipides, des vitamines et d'autres composés, tels que l'isoleucyl-valine, le CL(i-16:0/a-17:0/18:2(9Z,11Z)/i-24:0), la déthiobiotine et l'acide alpha-cétoglutarique isoniazide, etc. Après 12 h de culture P72N, des métabolites bioactifs, notamment l'acide indolélactique, l'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque et le diacétyle, etc. ont été trouvés dans le milieu (MRS_P). Comme prévu, l'analyse métabolomique a révélé un changement notable dans les profils métaboliques à mesure que le milieu de croissance changeait. La production de composés bioactifs différait. Dans le milieu modifié, le P72N a induit exclusivement la production d'iodoantipyrine, de 2',4'-dihydroxy-7-méthoxy-8-prénylflavane, de quinidine N-oxyde, de vicriviroc, de bortézomib, de lomibuvir et de valnémuline. En revanche, il n'a produit du diacétyle, de la méthylisopelletierine et de l'asiaticoside que dans le milieu MRS. Il est à noter que le milieu modifié a favorisé la production d'une plus grande diversité de métabolites bioactifs, soulignant son potentiel à améliorer la fonctionnalité probiotique et son adéquation comme milieu alternatif.

Français Les variations des niveaux de métabolites identifiés dans le milieu de croissance entre la pré- et la post-culture ont été visualisées selon des cartes thermiques. Des cartes thermiques des 50 principaux métabolites de MM2_B vs. MM2_P et MRS_B vs. MRS_P basées sur des scores VIP > 2 ont été dessinées pour montrer les variations des concentrations de métabolites (Fig. 7). La Fig. 7A montre clairement que les niveaux de métabolites dans les milieux modifiés (MM2_B) étaient significativement différents de ceux de MM2_P après une culture de P72N pendant 12 h. Le groupe MM2_B présentait un nombre élevé de dipeptides, dont la phénylalanylproline, la phénylalanylarginine, le valyltryptophane, etc., qui constituaient une grande partie de sa composition, tandis que certains composés tels que la L-arginine, l'aconitate d'éthyle, la Fe(II)-nicotianamine et la niacinamide étaient également présents. Après 12 h de culture de P72N, les composés mentionnés ci-dessus du groupe MM_B ont été significativement régulés à la baisse dans le groupe MM2_P. En revanche, d'autres métabolites bioactifs tels que l'acide indolélactique, l'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque, l'isopentényl pyrophosphate, etc., ont été significativement régulés à la hausse dans le groupe MM2_P. La figure 7B montre que les taux de métabolites dans le milieu MRS_B différaient significativement de ceux du MRS_P. Le groupe MRS_B présentait un nombre élevé de dipeptides, dont l'isoleucyl-valine, la thréoninyl-valine, la leucylproline, etc., qui constituaient la majeure partie de sa composition. De plus, il contenait de plus petites quantités de L-arginine, d'acide isoniazide alpha-cétoglutarique et d'autres composés. Après 12 h de culture de P72N en milieu MRS, les taux de dipeptides du groupe MRS_B ont été significativement diminués dans le groupe MRS_P, à l'exception de la phényl-leucine, qui a été nettement augmentée dans le groupe MRS_P. Outre la phényl-leucine, d'autres métabolites bioactifs, notamment le diacétyle, l'acide indolelactique et l'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque, ont été significativement augmentés dans le groupe MRS_P.

Cartes thermiques des 50 principaux métabolites pour (A) MM_B vs. MM_P et (B) MRS_B vs. MRS_P basées sur des scores VIP > 2. Chaque colonne représente un échantillon, chaque ligne représente un métabolite et la couleur indique l'expression relative de ce métabolite dans ce groupe d'échantillons.

Français Les diagrammes en boîte illustrant la production d'acide lactique, d'acide butyrique, d'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque (DHNA), d'acide indolelactique (ILA) et de diacétyle par la souche P72N sont présentés dans la Fig. 8. Dans cette étude, il a été démontré que la souche P72N produisait de l'acide lactique, de l'acide butyrique, du DHNA et de l'ILA dans les milieux MRS et modifiés. Cependant, les niveaux d'acide lactique et d'acide butyrique étaient systématiquement inférieurs à ceux du DHNA et de l'ILA dans les deux milieux. Comparé au milieu MRS, P72N a produit une quantité plus élevée d'acide butyrique mais une quantité plus faible d'acide lactique dans le milieu modifié. De plus, le milieu modifié a favorisé une production plus élevée de DHNA et d'ILA, démontrant son efficacité pour la production de P72N. Cependant, la production de diacétyle par P72N a été observée exclusivement dans le milieu MRS.

Diagrammes en boîte de l'acide lactique, de l'acide butyrique, de l'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque, de l'acide indolelactique et du diacétyle produits par P72N dans les milieux avant et après incubation.

Les composants les plus cruciaux d'un milieu de culture pour la production de cellules bactériennes sont les sources de carbone et d'azote. En répondant à ces besoins et aux autres besoins nutritionnels de la souche, il devrait être possible d'obtenir une croissance optimale10. Il a été démontré que les espèces et même les souches de LAB ont des préférences pour différents sucres et différentes concentrations optimales. Il est donc important de choisir la bonne source de carbone et d'énergie, car celles-ci peuvent affecter la croissance et l'activité métabolique de LAB19. Les résultats de l'expérience de criblage des sources de carbone ont mis en évidence l'impact significatif de différentes sources de carbone sur la production cellulaire de P72N, avec des préférences claires. P72N a montré une préférence pour le dextrose comme principale source de carbone, le nombre de cellules viables le plus élevé étant atteint à 20 g/L de dextrose. Par conséquent, P72N peut utiliser efficacement le dextrose, probablement grâce à son mécanisme enzymatique spécifique qui favorise le métabolisme de ce sucre par rapport aux autres19.

Les espèces LAB sont des micro-organismes exigeants et ne peuvent pas se développer correctement sur des milieux minéraux simples contenant uniquement une source de carbone. Il est donc nécessaire de leur fournir une source d'azote nécessaire à la surproduction de biomasse11. De nombreuses études ont montré que la production de biomasse cellulaire de la plupart des espèces LAB peut être augmentée en présence d'extraits de viande et de levure, d'acides aminés, de concentrés de protéines, d'hydrolysats, de vitamines et de composés inorganiques tels que (NH4)2SO4 et (NH4)2HPO4 20,21. Les sources d'azote utilisées dans la présente étude étaient le lactosérum doux, l'extrait de bœuf et l'extrait de levure, tous de qualité alimentaire, bon marché et facilement accessibles à Bangkok. Le lactosérum doux est un sous-produit majeur de l'industrie laitière, contenant du lactose, des protéines, des lipides et des sels minéraux, qui sont appropriés pour fournir des facteurs de croissance aux souches LAB utilisant le lactose21. L'extrait de bœuf contient une gamme diversifiée de nutriments, tels que des acides aminés, des peptides, des vitamines et des minéraux, tous essentiels à la croissance et au métabolisme microbiens22. L'extrait de levure est connu pour sa richesse en vitamines B, en acides aminés libres et en peptides, essentiels aux voies de biosynthèse et de production d'énergie des LAB23,24. L'étude actuelle a révélé que l'extrait de levure était la seule source d'azote ayant démontré un effet statistiquement significatif sur la production de cellules viables. Cela indique que P72N dépend fortement des nutriments complexes et des facteurs de croissance présents dans l'extrait de levure, notamment des acides aminés, des peptides et diverses vitamines qui favorisent une croissance cellulaire robuste23,24.

L'utilisation du RSM a permis d'identifier des formulations de milieux optimisées pour le P72N et a démontré l'importance d'équilibrer l'apport en nutriments avec les considérations de coût. L'utilisation d'ingrédients économiques comme l'extrait de levure, combinés à des concentrations appropriées de glucides et de minéraux essentiels, garantit une viabilité cellulaire élevée et une croissance robuste. Étant donné que le PBD et le RSM avec CCD sont tous deux basés sur des statistiques, l'adéquation du modèle peut être vérifiée en examinant les valeurs R2. Généralement, la valeur R2 est comprise entre 0 et 1, et à des valeurs plus proches de 1, le modèle peut mieux prédire la réponse. Un modèle avec un R2 > 0,75 est considéré comme acceptable25. La précision du modèle peut également être confirmée par un défaut d'ajustement statistiquement non significatif (p > 0,05)26. Dans la présente étude, les valeurs R2 et les valeurs de défaut d'ajustement des expériences PBD et CCD étaient toutes en accord acceptable, indiquant la pertinence et la précision du modèle. Sur la base de l'expérience RSM, une formulation de milieu comprenant 20 g/L de dextrose, 45 g/L d'extrait de levure, 1 g/L de Tween 80, 2 g/L de C6H14N2O7, 2 g/L de K2HPO4, 5 g/L de CH3COONa, 0,1 g/L de MgSO4.7H2O et 0,05 g/L de MnSO4.H2O a été initialement identifiée comme un milieu modifié approprié (MM1) pour P72N.

Français Dans les procédés de fermentation industrielle, tels que ceux utilisés dans la production de probiotiques, les sucres servent de principale source d'énergie pour les micro-organismes. Si ces sucres ne sont pas pleinement utilisés pendant la fermentation, ils peuvent rester sous forme de résidus dans le milieu de fermentation, entraînant plusieurs conséquences néfastes telles que la contamination des eaux usées, le déséquilibre microbien et la perturbation des nutriments du sol27. Des ratios de sources de carbone élevés peuvent conduire à des sucres inutilisés qui affectent la qualité du produit et contribuent à la pollution de l'environnement27. Par conséquent, pour réduire les résidus de sucre associés à la fermentation dans MM1, une formulation de milieu final (MM2) contenant 10 g/L de dextrose, 45 g/L d'extrait de levure, 1 g/L de Tween 80, 2 g/L de C6H14N2O7, 2 g/L de K2HPO4, 5 g/L de CH3COONa, 0,1 g/L de MgSO4.7H2O et 0,05 g/L de MnSO4.H2O a été choisie pour des expériences de mise à l'échelle ultérieure.

Français Les résultats des expériences de fermentation dans des flacons de 250 mL utilisant MM2 ont fourni des informations précieuses sur la vitesse d'agitation optimale pour maximiser la croissance de P72N. Des numérations cellulaires acceptables ont été obtenues à une vitesse d'agitation de 120 tr/min après une période de fermentation plus courte de 12 h. Le succès de cette faible vitesse d'agitation suggère que P72N préfère un transfert d'oxygène relativement faible et une faible contrainte de cisaillement. Cela pourrait être attribué aux caractéristiques métaboliques de la souche et à sa capacité à prospérer dans des environnements moins turbulents28,29. Une agitation appropriée améliore non seulement la disponibilité des nutriments et l'élimination des déchets, mais influence également l'état physiologique des cellules, ce qui est essentiel pour atteindre des densités cellulaires élevées30. Les expériences de fermentation dans des flacons de 500 mL ont révélé des améliorations significatives de la croissance cellulaire et de l'efficacité de la fermentation en utilisant le milieu modifié. MM2 a permis des rendements cellulaires plus élevés après une période de fermentation de 12 h, avec une meilleure utilisation du substrat et une meilleure production d'acide par rapport au milieu MRS commercial. Par conséquent, MM2 a été choisi pour une mise à l'échelle supplémentaire dans des bioréacteurs de 5 L et des fermenteurs de 50 L, ouvrant la voie à une production industrielle plus efficace de la souche P72N. Les résultats des expériences de fermentation à grande échelle ont indiqué que des rendements cellulaires plus élevés ont été observés après une période de fermentation de 12 h dans les bioréacteurs de 5 L et les fermenteurs de 50 L, avec une utilisation du substrat et une production d'acide acceptables, permettant ainsi un processus de fermentation plus court et efficace. Les niveaux de pH et les sucres résiduels observés à la fin de la période de fermentation sont révélateurs de l'activité métabolique de la souche LAB, principalement de sa production d'acide lactique. Le maintien d'un pH optimal est crucial car des niveaux de pH extrêmes peuvent inhiber la croissance bactérienne et les fonctions métaboliques. Les valeurs de pH légèrement acides sont typiques de la fermentation LAB et reflètent une utilisation efficace des sucres et une production d'acide lactique, une caractéristique recherchée pour de nombreuses applications industrielles31. Globalement, le milieu modifié s'est avéré efficace pour la culture de la souche P72N à différentes échelles, favorisant des rendements cellulaires élevés et une utilisation efficace du substrat. Les temps de fermentation optimaux identifiés guideront la future production à grande échelle, garantissant une fabrication cohérente et rentable de cette souche.

Un produit probiotique doit résister à divers facteurs de stress rencontrés lors de la fabrication, du stockage, du transport et du transit intestinal. Les tests de tolérance évaluent généralement la résistance aux facteurs de stress courants tels que la chaleur, le stress oxydatif, l'exposition à la bile et les faibles pH, reflétant les défis rencontrés lors du traitement et de la digestion2,32. La souche probiotique P72N a été initialement sélectionnée dans notre étude précédente pour sa tolérance au stress acide et biliaire5. Cependant, des modifications de l'environnement de croissance et de la composition du milieu peuvent influencer la viabilité des probiotiques, la résistance au stress et la synthèse de composés bénéfiques. Les cellules P72N cultivées en MM1 et MM2 ont montré une meilleure résistance à la chaleur et au stress biliaire que celles cultivées en milieu MRS commercial, avec une tolérance oxydative similaire. Cependant, elles étaient nettement plus sensibles aux conditions acides. Le mécanisme sous-jacent de la sensibilité à l'acide implique l'accumulation d'acide lactique, des lésions des membranes cellulaires, une altération des systèmes de transport et une entrave à la production de protéines de stress et à une réponse efficace de tolérance à l'acide. Les limitations nutritionnelles aggravent encore la fonction enzymatique, augmentant la sensibilité à l'acide33,34. En partie, cette limitation potentielle de l’utilisation de milieux modifiés est susceptible d’être surmontée par la microencapsulation de la souche avant son application8.

Français Les métabolites représentent les produits finaux des processus de régulation cellulaire, dont les niveaux sont régulés en réponse aux changements environnementaux au sein des systèmes biologiques35. Dans cette étude, le profilage métabolomique a démontré un changement significatif dans la composition des métabolites de notre souche probiotique P72N lorsqu'elle était cultivée dans des milieux modifiés par rapport au milieu MRS standard. Le milieu modifié a amélioré la production d'une plus large gamme de métabolites bénéfiques, soulignant son potentiel à améliorer les propriétés biofonctionnelles des probiotiques ainsi que son adéquation comme milieu alternatif. Cette étude a démontré que P72N produisait de l'acide lactique, de l'acide butyrique, de l'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque (DHNA) et de l'acide indolelactique (ILA) dans les milieux MRS et modifiés. Cependant, les concentrations d'acide lactique et d'acide butyrique étaient systématiquement inférieures à celles de DHNA et d'ILA. L'acide lactique est produit par fermentation de bactéries lactiques par un processus métabolique qui convertit le glucose ou d'autres sucres en acide lactique et en énergie cellulaire. Le P72N peut utiliser le dextrose comme principale source de carbone et le fermenter principalement via la voie homofermentaire Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pour produire de l'acide lactique comme principal produit final. L'acide lactique peut contribuer à maintenir l'acidité intestinale, créant ainsi un environnement hostile aux agents pathogènes. Cependant, un excès de lactate peut nuire à la santé intestinale36. L'acide butyrique est un acide gras à chaîne courte (AGCC) qui contribue à préserver la barrière intestinale, à inhiber l'inflammation et à moduler la flore intestinale, contribuant ainsi à une meilleure santé intestinale37. Il favorise la santé intestinale en servant de principale source d'énergie aux colonocytes et en renforçant la barrière intestinale. Il présente également des effets anti-inflammatoires en modulant les réponses immunitaires et en inhibant les voies de signalisation inflammatoires telles que NF-κB. De plus, l'acide butyrique favorise un microbiote intestinal sain et aide à supprimer les bactéries pathogènes, contribuant ainsi à l'homéostasie intestinale globale. Français Dans cette étude, la souche P72N a produit du DHNA et de l'ILA dans les deux milieux, mais leur abondance était plus élevée dans le milieu modifié, démontrant son efficacité et son adéquation à la production de P72N. Bien que de faibles niveaux d'acides lactique et butyrique puissent limiter certaines fonctionnalités probiotiques traditionnelles, la production élevée de DHNA et d'ILA dans notre milieu modifié présente un nouveau profil métabolique avec des avantages alternatifs pour la santé intestinale. Le DHNA, dérivé de la fermentation bactérienne, est un nouveau type de prébiotique équilibrant la flore intestinale38 et atténuant l'inflammation colique par immunomodulation39. Il favorise la croissance de Bifidobacterium spp., ce qui améliore la diversité microbienne et renforce l'intégrité de la barrière intestinale. Il module également les réponses immunitaires en supprimant les cytokines pro-inflammatoires et en régulant la signalisation NF-κB, atténuant ainsi l'inflammation colique. L'ILA est un métabolite bactérien intestinal bénéfique connu pour réduire l'inflammation, corriger la dysbiose microbienne40 et inhiber les pathogènes41. La DHNA est un intermédiaire dans la biosynthèse de la ménaquinone (vitamine K2) par la voie du shikimate. Dans les bactéries lactiques, cette voie part du chorismate, qui est converti par une série d'étapes enzymatiques impliquant menF, menD, menH et d'autres gènes men pour produire de la DHNA. L'augmentation des taux de DHNA dans MM2 suggère que le milieu modifié pourrait favoriser le flux via la voie de la ménaquinone, potentiellement en raison d'une abondance de métabolites précurseurs comme le chorismate ou d'une compétition réduite pour les intermédiaires de la voie. L'ILA est dérivée de la voie du métabolisme du tryptophane. Chez les bactéries lactiques, le tryptophane est transaminé par les aminotransférases d'acides aminés aromatiques (ArAT) en indolepyruvate, qui est ensuite réduit en ILA par l'indolelactate déshydrogénase. L'augmentation des taux d'ILA dans MM2 suggère que le milieu contient soit des taux plus élevés de tryptophane, soit des composants qui régulent positivement la voie du métabolisme du tryptophane. Des métabolites comme le DHNA et l'ILA pourraient également jouer un rôle intracellulaire dans l'extinction des espèces réactives de l'oxygène ou la modulation de l'intégrité membranaire, améliorant ainsi indirectement la résilience au stress. En revanche, la sensibilité aux acides observée dans les cellules cultivées sur MM2 pourrait provenir d'une capacité tampon plus faible du milieu ou d'un manque d'homéostasie du pH dérivée des acides aminés. Dans cette étude, le diacétyle, un composé aromatique naturel produit par les souches LAB par le métabolisme du citrate, n'a été synthétisé que par P72N en milieu MRS. L'absence de production de diacétyle dans MM2 résulte probablement de l'absence ou de la faible concentration de citrate. Le citrate agit comme substrat de la citrate lyase, conduisant à la synthèse d'acétoïne et de diacétyle. Une étude a suggéré qu'une supplémentation en citrate améliore significativement la production de diacétyle dans certains LAB42. Sur cette base, l'incorporation de citrate dans le milieu modifié est recommandée pour stimuler la production de diacétyle, améliorant ainsi le profil aromatique des produits fermentés.

Cette étude a consisté en un processus d'optimisation étape par étape pour créer un milieu modifié rentable pour la production industrielle du probiotique natif thaïlandais P. acidilactici 72 N. En remplaçant les ingrédients des milieux MRS commerciaux par des substrats de qualité alimentaire, nous avons réussi à produire notre souche probiotique à l'échelle industrielle avec des rendements cellulaires plus élevés tout en réduisant significativement le coût des milieux de production d'environ 67 à 86 % par rapport aux milieux MRS commerciaux. De plus, les cellules cultivées dans les milieux modifiés ont montré de bonnes réponses aux stress pouvant survenir lors de la fabrication, de la distribution et de l'utilisation des souches probiotiques. Ces évaluations fournissent des informations sur l'adaptation et la résilience de la souche probiotique aux changements environnementaux, améliorant ainsi notre compréhension de ses réponses physiologiques et de ses capacités métaboliques dans des conditions de croissance optimisées. L'utilisation de milieux modifiés rentables a été associée à une augmentation significative de la production de métabolites bénéfiques pour la santé intestinale, tels que l'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque et l'acide indolelactique, soulignant l'efficacité de ces milieux sur mesure pour préserver et améliorer la fonctionnalité probiotique. Cette étude présente une stratégie d'optimisation rentable du milieu de culture qui, contrairement à la plupart des approches existantes, garantit la préservation des caractéristiques probiotiques clés, comblant ainsi une lacune critique, mais souvent négligée, dans la recherche actuelle sur la production de probiotiques. L'exploration de l'évolutivité de ce milieu de culture modifié, rentable et de qualité alimentaire, à grande échelle mérite d'être approfondie. De futures recherches pourraient examiner l'efficacité du probiotique encapsulé P72N pour une utilisation in vivo comme additif alimentaire dans les élevages porcins et les industries de transformation des aliments.

La souche 72 N (P72N) de Pediococcus acidilactici a été obtenue à partir de la collection de cultures de la Faculté des sciences vétérinaires de l'Université Chulalongkorn. Elle a été initialement isolée des excréments de porcs indigènes thaïlandais. Elle a été suggérée comme candidat probiotique potentiel pour la supplémentation alimentaire des porcs3. Les cellules ont été maintenues dans un bouillon MRS avec 20 % de glycérol à -20 °C. Elles ont été réactivées par étalement sur gélose MRS et incubation pendant 48 h à 37 °C. Entre 5 et 10 colonies de P72N provenant de boîtes de Pétri fraîchement cultivées ont été repiquées dans 10 ml de bouillon MRS et incubées à 37 °C en conditions statiques. Après 18 h d'incubation, la culture cellulaire a été centrifugée à 5 000 tr/min pendant 10 min, le surnageant a été éliminé et les culots cellulaires ont été lavés deux fois avec une solution saline normale à 0,85 %. Les cellules ont été remises en suspension dans une solution saline normale et la densité optique (DO) a été ajustée à 0,8 ± 0,05 à une longueur d'onde de 600 nm afin d'obtenir une densité cellulaire équivalente à 108 unités formant colonie par millilitre (UFC/mL). Cette suspension cellulaire a servi d'inoculum de base pour des expériences ultérieures.

La méthode OVAT a été utilisée pour étudier les effets des sources de carbone sur la production de cellules bactériennes. Cette méthode permet d'évaluer l'impact de chaque variable individuellement, mais ne prend pas en compte les interactions entre les variables26. Chacune des sources de carbone de qualité alimentaire, notamment le glucose (C6H12O6), le dextrose (C6H12O6.H2O) et le saccharose (C12H22O11), a été préparée à des concentrations de 10 g/L, 20 g/L et 30 g/L, chacune complétée par 10 g/L d'extrait de levure. Les minéraux et les agents tampons, dont 1 g/L de Tween 80, 2 g/L de citrate d'ammonium (C6H14N2O7), 2 g/L d'hydrogénophosphate dipotassique (K2HPO4), 5 g/L d'acétate de sodium (CH3COONa), 0,1 g/L de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H2O) et 0,05 g/L de sulfate de manganèse monohydraté (MnSO4.H2O), ont été ajoutés à chaque formulation de milieu aux mêmes concentrations que celles du milieu MRS. Le pH initial de tous les milieux a été fixé à 6,5 ± 0,05 en utilisant de l'hydroxyde de sodium (NaOH) 1 M et de l'acide chlorhydrique (HCl) 1 M avant stérilisation. Environ 1 % (v/v) d'inoculum issu de la suspension cellulaire (environ 108 UFC/mL) de P72N a été inoculé dans des tubes à bouchon à vis de 15 mL contenant 10 mL de milieu stérilisé. Après incubation des tubes à 37 °C pendant 24 h en conditions statiques, le nombre de cellules viables a été déterminé par la méthode de la plaque à goutte. L'expérience a été réalisée en triple. Les sources de carbone améliorant significativement la production de cellules viables ont été sélectionnées pour des expérimentations ultérieures.

Le PBD a été réalisé afin d'identifier les sources d'azote significatives influençant la production de P72N par des cellules viables. Le protocole comprenait un mélange de trois variables (extrait de bœuf, extrait de levure et lactosérum doux). La statistique de Plackett-Burman a été utilisée pour définir les niveaux de concentration des variables, ce qui a donné lieu à une matrice de conception avec des séries expérimentales et des valeurs codées (+ 1, -1) représentant différentes concentrations. Les milieux ont été préparés à partir de cette matrice, en incorporant la source de carbone la plus adaptée au P72N (dextrose), déterminée lors de l'expérience précédente. Les minéraux et les agents tampons ont été ajoutés à chaque formulation aux mêmes concentrations que celles du milieu MRS. Avant stérilisation, le pH initial de tous les milieux a été ajusté à 6,5 ± 0,05. Environ 1 % (v/v) d'inoculum a été ajouté à 10 ml de chaque formulation de milieu et incubé à 37 °C pendant 24 h en conditions statiques. Le nombre de cellules viables a été mesuré par la méthode de la plaque de dépôt, les expériences étant réalisées en triple. L'équation polynomiale du premier ordre suivante a été utilisée pour effectuer la modélisation mathématique : où Y est la réponse (nombre de cellules), β0, βi et Xi sont respectivement l'interception du modèle, les coefficients de régression et les variables indépendantes.

Les sources d’azote les plus appropriées qui ont influencé positivement la production de cellules viables avec un niveau de confiance supérieur à 95 % ont été sélectionnées pour des expérimentations plus poussées10,26.

Un RSM avec un dispositif composite central (CCD) a été utilisé pour optimiser les concentrations des composants du milieu et évaluer les effets de chaque variable et leurs interactions. D'après les résultats de l'expérience PBD, les sources de carbone et d'azote les plus influentes (dextrose et extrait de levure) ont été utilisées comme variables indépendantes. Après avoir déterminé les niveaux de concentration de chaque variable indépendante, le CCD a fourni une matrice de conception avec des essais et des valeurs codées représentant les différentes concentrations de chaque variable. Les milieux ont été préparés selon cette matrice, en incorporant les mêmes concentrations de minéraux et d'agents tampons. Le pH initial de tous les milieux a été ajusté à 6,5 ± 0,05 avant stérilisation. Environ 1 % d'inoculum a été ajouté à 10 ml de chaque formulation et incubé à 37 °C pendant 24 h en conditions statiques. Le nombre de cellules a été déterminé par la méthode de la plaque à goutte. L'expérience a été menée en triple. Les numérations de cellules viables ont été utilisées pour développer un modèle de régression, avec l'équation polynomiale quadratique pour les variables comme suit :

où Y est la valeur de réponse des variables dépendantes ; β0, βi, βij et βii sont respectivement les coefficients d'interception, linéaire, d'interaction et au carré du modèle ; Xi et Xj sont les variables indépendantes. La formulation du milieu qui a significativement amélioré la production de cellules viables avec un niveau de confiance supérieur à 95 % a été choisie pour des expériences plus poussées10,26.

Pour déterminer l'effet de la vitesse d'agitation (0 tr/min, 120 tr/min et 200 tr/min) sur la production cellulaire de P72N, la fermentation a été réalisée dans un flacon de 250 ml en utilisant le milieu modifié optimal avec un volume de travail de 50 ml. Le pH du milieu modifié a été ajusté à 6,5 ± 0,05 avant stérilisation. Le milieu modifié stérilisé a été inoculé avec 1 % d'inoculum, puis les flacons ont été incubés dans des incubateurs à agitation à 37 °C pendant 24 h. Le nombre de cellules viables, les valeurs de pH et les sucres résiduels ont été examinés à des intervalles de 6 h. L'expérience a été réalisée en triple.

La fermentation du P72N a été réalisée dans un flacon de 500 mL en utilisant le milieu modifié optimal avec un volume utile de 350 mL. Le milieu stérilisé a été inoculé avec 1 % d'inoculum, puis les flacons ont été incubés à 37 °C pendant 24 h avec une vitesse d'agitation de 120 tr/min. Le milieu MRS a été utilisé comme milieu de comparaison et la fermentation a été réalisée dans les mêmes conditions. La viabilité cellulaire, le pH et les sucres résiduels dans le milieu ont été mesurés à intervalles de 3 h. L'expérience a été réalisée en triple.

La fermentation par lots de P72N a été réalisée dans un bioréacteur de 5 L (BE Marubishi co., Ltd.) et un fermenteur de 50 L (BE Marubishi co., Ltd.). Le milieu modifié a été préparé et stérilisé à 121 °C pendant 20 min. La préparation de deux inoculums subcultivés consécutifs pour une fermentation de 5 L et 50 L s'est déroulée comme suit : 1 % d'inoculum des suspensions cellulaires (– 108 UFC/mL) a été inoculé dans la quantité souhaitée de milieu modifié stérilisé dans un flacon et incubé à 37 °C pendant 18 h avec une vitesse d'agitation de 120 tr/min. La culture en flacon a été utilisée comme inoculum pour une fermentation ultérieure. Le volume de travail total était de 3,5 L pour le bioréacteur de 5 L et de 35 L pour le fermenteur de 50 L. Le milieu modifié stérilisé a été inoculé avec 1 % de l'inoculum issu de la culture en flacon. La fermentation a été réalisée pendant 24 h à 37 °C et à un pH de 6,5 ± 0,05 avec une vitesse d'agitation de 120 tr/min. La viabilité cellulaire, le pH et les sucres résiduels ont été examinés à intervalles de 3 h. L'expérience a été réalisée en triple.

Français Des tests de stress ont été réalisés pour évaluer les caractéristiques probiotiques de la souche P72N cultivée en milieu modifié (MM). Les cultures ont été soumises à des stress thermiques, oxydatifs, biliaires et acides après une incubation de 24 h en MRS et en MM. Des comptages d'UFC ont été effectués avant et après chaque test pour déterminer le pourcentage de survie. Le test thermique consistait à placer 2 mL de culture P72N dans un tube Falcon™ de 15 mL dans un bain-marie à 60 °C pendant 10 min43. Pour le test oxydatif, 1,25 mM de peroxyde d'hydrogène a été ajouté à 2 mL de culture P72N et incubé pendant 1 h à 37 °C44. Le test acide a été induit par centrifugation de 2 mL de culture P72N à 6 000 × g pendant 10 min, puis remise en suspension dans le même milieu de croissance ajusté à pH 2,5 à l'aide de HCl, suivie d'une incubation d'1 h à 37 °C45. La provocation biliaire a été réalisée en inoculant 1 % d'une suspension cellulaire P72N dans 2 ml de MRS et de MM supplémentés avec 1 % (p/v) de sels biliaires (Oxgall, Sigma-Aldrich, Australie), puis en incubant à 37 °C pendant 24 h. Le taux de survie (%) dans les tests de tolérance au stress a été calculé comme suit : (nombre de cellules viables après provocation/nombre de cellules viables avant provocation) x 100 46.

Environ 1 % de l'inoculum (3,5 mL) de la suspension cellulaire (~ 10⁸ UFC/mL) de P72N a été cultivé dans un flacon de 500 mL contenant 350 mL de milieu MM2 ou MRS. Les flacons ont été incubés à 37 °C pendant 12 h dans un incubateur à agitation à une vitesse de 200 tr/min. Après incubation, des surnageants acellulaires (CFS) ont été obtenus par centrifugation. Environ 2 mL de chaque CFS ont été mélangés à 4 mL d'acétonitrile froid (-20 °C) pour la précipitation des protéines dans un bain de glace pendant 20 min. Après centrifugation (11 000 tr/min, 10 min, 10 °C), les surnageants ont été transférés dans des tubes Eppendorf et concentrés à l'aide d'un concentrateur sous vide (30 °C pendant 2,5 h). Les échantillons séchés ont été conservés à -80 °C jusqu'à analyse ultérieure. L'analyse métabolomique a été réalisée par chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à une spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire par ionisation par électrospray (UHPLC-ESI-Q-TOF-MS) (Bruker's Compact), avec une colonne C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm) à 55 °C et un passeur automatique réglé à 10 °C. Les phases mobiles étaient constituées d'eau avec 0,1 % d'acide formique (A) et de méthanol avec 0,1 % d'acide formique (B), avec un débit de gradient de 0,4 mL/min. Des échantillons (4 µL) ont été injectés pour analyse en mode ionisation positive, en utilisant du méthanol à 70 % comme blanc. Après chaque cinq échantillons, des blancs de méthanol et un échantillon de contrôle qualité ont été analysés pour garantir la reproductibilité et éviter toute contamination croisée. Le formiate de sodium a été utilisé comme étalon externe. L'acquisition des données comprenait une plage de masse de 50 à 1 300 m/z dans des conditions d'ionisation spécifiées (par exemple, tension capillaire : 4 500 V ; température sèche : 200 °C ; nébuliseur : 0,5 bar). Des analyses de données multivariées, y compris PCA, PLS-DA et le test t de Student, ont été réalisées à l'aide de MetaboAnalyst 5.0 pour identifier les métabolites différentiels dans le CFS entre la pré- et la post-culture de P72N.

Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type (ET). Les PBD et RSM ont été réalisés avec Minitab version 20. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour étudier les effets des variables sur la production de cellules viables, le pH et les sucres résiduels. Les valeurs étaient considérées comme significatives à p < 0,05. Le test de Duncan à plages multiples (DMRT) a été utilisé pour déterminer le degré de significativité des différences entre les valeurs moyennes. Toutes les analyses ont été réalisées avec SAS version 9.

Les données sont fournies dans le manuscrit ou dans des fichiers d’informations supplémentaires.

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Cette étude a bénéficié du soutien financier de l'Agence de développement de la recherche agricole (CRP6605031420), des bourses doctorales du Secondary Century Fund (C2F) et de la bourse du 90e anniversaire de l'Université Chulalongkorn (Fonds de dotation Ratchadaphiseksomphot), Université Chulalongkorn, Bangkok, Thaïlande. Les auteurs remercient KMP Biotechnology Co. Ltd. pour l'accès aux installations de mise à l'échelle.

Département de microbiologie, Faculté des sciences vétérinaires, Université Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thaïlande

Nay Zin Myo, Ratchnida Kamwa, Benjamin Khurajog et Nuvee Prapasarakul

Cours international de deuxième cycle en sciences et technologies vétérinaires, Faculté des sciences vétérinaires, Université Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thaïlande

Nay Zin Myo et Ratchnida Kawa

Centre d'excellence en diagnostic et surveillance des agents pathogènes animaux (DMAP), Faculté des sciences vétérinaires, Université Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thaïlande

Wandee Sirichokchatchawan et Nuvee Prapasarakul

Département de biologie, Faculté des sciences, Université Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thaïlande

Chrysalide latérale

Faculté des sciences de la santé publique (CPHS), Université Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thaïlande

Wandee Sirichokchatchawan

École de médecine vétérinaire, Université Murdoch, Perth, WA 6150, Australie

David J. Hampson

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Tous les auteurs ont apporté de précieuses contributions au processus de recherche dans cette étude. Conceptualisation : NZM, PP, WS et NP ; méthodologie : NZM, RK, BK et PP ; investigation : NZM, RK, BK, PP et WS ; validation : NZM, RK, BK, PP et WS ; logiciel : NZM ; rédaction — ébauche originale : NZM ; rédaction — révision et édition : NZM, DJH et NP ; visualisation : NZM et NP ; supervision ; NP ; administration du projet : NP ; acquisition de financement : NZM, RK et NP Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance avec Nuvee Prapasarakul.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité institutionnel de biosécurité de la Faculté des sciences vétérinaires de l'Université Chulalongkorn (Protocol Review No. IBC-2431023).

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Réimpressions et autorisations

Myo, NZ, Kamwa, R., Khurajog, B. et al. Production industrielle et profilage fonctionnel du probiotique Pediococcus acidilactici 72 N pour une utilisation potentielle comme additif alimentaire pour porcs. Sci Rep 15, 14940 (2025). https://doi.org/10.1038/s41598-025-99826-8

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Reçu : 26 novembre 2024

Accepté : 23 avril 2025

Publié le 29 avril 2025

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-025-99826-8

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